Princip eksperimenta
Elektroforeza hemoglobina ima za cilj da otkrije i potvrdi različite normalne i abnormalne hemoglobine.
Zbog različitih naboja i izoelektričnih tačaka različitih tipova hemoglobina, u određenoj pH otopini pufera, kada je izoelektrična točka hemoglobina niža od pH otopine pufera, hemoglobin nosi negativan naboj i migrira prema anodi tokom elektroforeze. Obrnuto, hemoglobin sa pozitivnim nabojem kreće se prema katodi.
Pod određenim naponom i nakon određenog vremena elektroforeze, hemoglobini različitog naboja i molekularne težine pokazuju različite smjerove i brzine migracije. Ovo omogućava odvajanje različitih zona, a naknadna kolorimetrijska ili elektroforetska analiza skeniranja može se izvršiti na tim zonama kako bi se kvantificirali različiti hemoglobini. Najčešće korištena metoda je pH 8,6 elektroforeza celulozno acetatne membrane.
Unutar citoplazme, grupe etilen glikola (CHOH-CHOH) prisutne u glikogenu ili polisaharidnim supstancama (kao što su mukopolisaharidi, mukoproteini, glikoproteini, glikolipidi, itd.) se oksidiraju periodičnom kiselinom i pretvaraju u aldehidne grupe (CHO-CHO). Ove aldehidne grupe se kombinuju sa bezbojnim purpurno-crvenim Schiffovim reagensom, formirajući ljubičasto-crvenu boju koja se taloži tamo gde su polisaharidi prisutni u ćeliji. Ova reakcija je poznata kao bojenje periodičnom kiselinom-Schiff (PAS), ranije nazvano bojenje glikogenom.
Metoda eksperimenta
Materijali:Celuloza acetatmembrane, aparat za elektroforezu(DYCP-38C i napajanje DYY-6C), Vrhunski alat za učitavanje uzorka (pipeta), spektrofotometar, kolorimetrijske kivete, tamponima.
tampon:
(1) pH 8,6 TEB pufer: Odmeriti 10,29 g Tris, 0,6 g EDTA, 3,2 g borne kiseline i dodati destilovanu vodu u 1000 ml.
(2) Boratni pufer: Odmeriti 6,87 g boraksa i 5,56 g borne kiseline i dodati destilovanu vodu u 1000 ml.
Procedura:
Preparacija rastvora hemoglobina
Uzmite 3 ml krvi koja sadrži heparin ili natrijum citrat kao antikoagulans. Centrifugirajte na 2000 o/min 10 minuta i bacite plazmu. Isperite crvena krvna zrnca tri puta fiziološkom otopinom (750 o/min, svaki put 5 minuta centrifugiranja). Centrifugirajte na 2200 o/min 10 minuta i bacite supernatant. Dodajte jednaku količinu destilovane vode, a zatim dodajte 0,5 puta zapreminu ugljen-tetrahlorida. Snažno protresite 5 minuta, a zatim centrifugirajte na 2200 o/min 10 minuta kako biste prikupili gornji rastvor Hb za kasniju upotrebu.
Natapanje membrane
Izrežite celulozno acetatnu membranu na trake dimenzija 3 cm × 8 cm. Potopite ih u pufer pH 8,6 TEB do potpunog zasićenja, zatim uklonite i osušite filter papirom.
Uočavanje
Upotrijebite pipetu da 10 μl otopine hemoglobina usmjerite vertikalno na celulozno acetatnu membranu (hrapava strana), oko 1,5 cm od ruba.
Elektroforeza
Sipajte rastvor boratnog pufera u komoru za elektroforezu. Postavite celulozno acetatnu membranu sa uočenom stranom na katodni kraj komore. Radite na 200 V 30 minuta.
Elucija
Izrežite HbA i HbA2 zone, stavite ih u odvojene epruvete i dodajte 15 ml, odnosno 3 ml destilovane vode. Lagano protresite da se hemoglobin potpuno eluira, a zatim promiješajte.
Kolorimetrija
Uklonite apsorbanciju pomoću destilovane vode za rastvor za eluiranje i izmerite apsorbanciju na 415 nm.
Kalkulacija
HbA2(%) = Apsorbanca HbA2 epruvete / (Apsorbanca HbA epruvete × 5 + Apsorpcija HbA2 epruvete) × 100%
Proračun eksperimentalnih rezultata
Referentni raspon za pH 8,6 TEB pufer celulozni acetat elektroforeza: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%
Bilješke
Vrijeme elektroforeze ne smije biti predugo. Celuloza acetatna membrana ne bi trebalo da se osuši tokom elektroforeze. Zaustavite elektroforezu kada su HbA i HbA2 jasno razdvojeni. Produžena elektroforeza može uzrokovati difuziju trake i zamućenje.
Izbjegavajte korištenje previše uzorka. Prekomjerna tečnost hemoglobina može dovesti do odvajanja trake ili nedovoljnog bojenja, što rezultira lažno povišenim nivoima HbA.
Spriječiti kontaminaciju celulozno acetatne membrane proteinima.
Struja ne bi trebala biti previsoka; inače, hemoglobinske trake se možda neće odvojiti.
Uvek uključite uzorke od normalnih pojedinaca i neophodne poznate abnormalne hemoglobine kao kontrole.
Peking Liuyi Biotechnology proizvodi profesionalni rezervoar za elektroforezu za elektroforezu hemoglobina koji je modelDYCP-38CSpremnik za elektroforezu sa celulozno acetatnom membranom, a postoje dva modela napajanja za elektroforezu za elektroforezni rezervoar sa membranom od celuloze acetataDYY-2CiDYY-6Cnapajanje.
U međuvremenu, Beijing Liuyi Biotechnology nudi membranu od celuloznog acetata za kupce, a veličina celulozno acetatne membrane može se prilagoditi. Dobrodošli da nas pitate za uzorke i više informacija.
Beijing Liuyi brend ima više od 50-godišnju istoriju u Kini i kompanija može da obezbedi stabilne i visokokvalitetne proizvode širom sveta. Kroz godine razvoja, dostojan je vašeg izbora!
Sada smo u potrazi za partnerima, i OEM rezervoar za elektroforezu i distributeri su dobrodošli.
Ako imate plan kupovine za naše proizvode, slobodno nas kontaktirajte. Možete nam poslati poruku na email[email protected]ili[email protected], ili nas pozovite na +86 15810650221 ili dodajte Whatsapp +86 15810650221, ili Wechat: 15810650221
Vrijeme objave: Sep-20-2023